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特异性标记、纯化ER驻留蛋白的试剂盒 ER-Protein Capture Kit

来源:作者:人气:-发表时间:2023-08-24 12:56:00【
2915119488886983.jpg特异性标记、纯化ER驻留蛋白的试剂盒
ER-Protein Capture Kit
ER-Protein Capture kit是一款利用荧光标记物特异性标记ER驻留蛋白,再使用标签捕获抗体通过免疫沉淀法纯化标记蛋白的试剂盒。可用于ER相关蛋白的全面鉴定与定量分析有或无刺激(例如内质网应激)下靶蛋白的ER驻留量。
※ 本产品是funakoshi基于京都大学工学研究科浜地格教授、田村朋则讲师的研究成果商品化销售的产品。
※ 本产品仅供研究使用。研究以外不可使用。
◆ER蛋白的回收方法与问题点
ER (内质网;Endoplasmic Reticulum)是一种通常在细胞内占据约20%体积的细胞器,结构非常复杂且遍布整个细胞。ER是负责细胞内蛋白质生物合成的中央细胞器,在多肽链合成、通过伴侣蛋白适当折叠、排除异常蛋白等,从生物合成到品质管理中起着重要作用。ER还担任分泌路径的一部分,是细胞膜蛋白和细胞外分泌蛋白通过的细胞器。另外,它还被认为对于脂质代谢和脂肪滴形成十分重要,因此能够分离、鉴定并定量分析ER蛋白的方法备受期待。然而,不同于其他细胞器,特异性纯化ER的的技术十分贫乏,选择性回收ER蛋白并不容易。
ER Protein Capture Kit是由京都大学浜地格教授、田村朋则讲师等开发的基于ER驻留蛋白标记技术商品化的ER蛋白选择性标记、纯化试剂盒。通过使用ER驻留蛋白标记试剂ERM ER-localizable Reactive Molecule),可以利用荧光标记物标记ER驻留蛋白,然后通过针对该标记物的特异性抗体进行纯化,选择性回收ER蛋白。无需超速离心机等特殊的机器,仅需简单操作便可纯化ER蛋白。除了能够通过蛋白组学进行全面鉴定外,本产品还适用于相对定量分析各种刺激处理下的ER驻留量。
◆试剂盒内容
本试剂盒由两部分组成。
A:ER驻留蛋白标记试剂ERM
(本试剂与产品名称为ERseeing、产品编号FDV-0038为同一试剂。可单独购买,也可以用作ER成像试剂)
B:标签捕获抗体(纯化兔多克隆IgG抗体)
※ 产品不包含用于细胞裂解液制备用的溶解缓冲液或免疫沉淀所需的Protein A / G树脂等。请另行购买。
◆原理和实验流程
ER驻留蛋白标记试剂ERM是一种在ER驻留性绿色荧光色素(Rhodol衍生物)上缀合蛋白标记基团的化合物。将ERM添加到活细胞后,由于色素部分的特性,显示出较高的ER驻留性。在ER中迅速浓缩后,通过蛋白标记基团用荧光标记物标记ER蛋白物(Step-1)。标记反应后破碎细胞制备细胞裂解液(Step-2),然后通过使用标签捕获抗体(抗Rhodol抗体)进行免疫沉淀(Step-3),可以选择性地回收被ERM标记的ER蛋白。由于回收的蛋白上带有荧光基团,使用SDS-PAGE分离后,可以通过CBB/银染或荧光成像仪检测出来(Step-4)。进行SDS-PAGE分离后,可以通过LC / MS进行全面蛋白组学分析或使用任何抗体的蛋白印迹法鉴定ER蛋白。
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◆原著论文
Fujisawa et al., J. Am. Chem. Soc.140, 17060~17070 (2018). Chemical Profiling of the Endoplasmic Reticulum Proteome Using Designer Labeling Reagents.
◆实验参考数据
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■ ERM的激发/发射光谱
  激发光谱(蓝)以及发射光谱(绿)
  ※适用于普通的绿色荧光色素FITC观察条件
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■ ER特异性检验
通过与各种细胞器标记共染色评价本试剂的ER特异性。观察到ERM(100 nM)与ER标记试剂高度共定位(皮尔逊相关系数>0.9)。另一方面,未观察到本试剂与溶酶体标记、线粒体标记的共定位。高尔基体标记观察到部分共定位,应该是因为本试剂所标记的蛋白通过Golgi体运输从ER转移至分泌路径。此外,添加ER-Golgi运输抑制剂的话,会减少与高尔基体的共定位(详细请参考原著论文)。
◆应用实例
通过蛋白组学全面分析回收蛋白
使用ERM (100 nM)处理HeLa细胞后,破碎细胞制备细胞裂解液。在裂解液中加入标签捕获抗体,使用Protein A磁珠进行免疫沉淀回收标记蛋白。将回收的蛋白通过SDS-PAGE分离后,切出每个条带,在凝胶中用胰蛋白酶/ Lys-C消化制备LC/MS样品。通过MS分析鉴定出共146种蛋白,其中63种蛋白是数据库上的ER蛋白,或是个别论文中确认了ER驻留的蛋白。73种蛋白作为细胞膜、细胞外分泌蛋白以及高尔基体蛋白被鉴定出来,它们都是存在于细胞外分泌路径的蛋白。由于存在于细胞外分泌途径的蛋白会途经ER,当这些蛋白在ER的时候便会被标记。因此,检测出来的蛋白中ER蛋白与途经ER的蛋白约占93%。本实验中检测出与ER无关的蛋白有10种,约占7%。
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R应激引起的ER驻留蛋白变动量的定量评价
通过SILAC定量分析法分析ER应激诱导的ER驻留蛋白的变动量。准备两份细胞,一份在SILAC Heavy标记培养基中培养,另一份在Light标记培养基中培养。在Heavy标记培养基的细胞中添加ER应激诱导试剂Tunicamycin培养4 h。而Light标记培养基无需任何处理培养4 h。之后,使用ERM(100 nM)处理1 h,分别制备细胞裂解液,再以1:1的比例混合。通过免疫沉淀法回收混合裂解液中的标记蛋白,然后与上述实验一样,制备LC/MS用样品。检测出了87种可相对定量的蛋白,再通过SILAC法算出由ER应激引起的变动量。其中6种蛋白因ER应激在ER上的存在量增加了两倍以上。
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※ 本页面产品仅供研究用,研究以外不可使用。
产品编号 产品名称 产品规格
FDV-0039 ER-Protein Capture Kit 1 Kit

 

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