厄运不断，CRISPR/Cas9基因编辑竟导致大片段DNA缺失和重排

来源：作者：人气：-发表时间：2018-07-18 14:51:00【大中小】

在几天前的一项研究中，来自美国伊利诺伊大学芝加哥分校的研究人员发现在利用CRISPR/Cas9进行基因编辑遭遇失败（大约在15％的时间发生）时，这通常是由于Cas9蛋白持续地结合到DNA上，这会阻止DNA修复酶进入切割位点。

科学家们已将CRISPR基因编辑作为一种改变基因组的方法，但有些人提醒道，不想要的DNA变化可能因未检测到而被遗漏。

针对人胚胎干细胞的基因编辑实验揭示出CRISPR-Cas9系统的不精确性。图片来自Annie Cavanagh via Wellcome/CC BY NC。

根据一项新的研究，这种基因编辑工具能够导致基因组上的靶位点附近发生大片段DNA缺失和重排。这些变化能够干扰对实验结果的解释，并且可能使得设计基于CRISPR的疗法的努力复杂化。相关研究结果于2018年7月17日在线发表在Nature Biotechnology期刊上，论文标题为“Repair of double-strand breaks induced by CRISPR–Cas9 leads to large deletions and complex rearrangements”。

这一发现不仅与CRISPR而且也与其他的基因编辑系统的之前结果相一致（Nature Communications, 2017, doi:10.1038/ncomms15464）。美国沙克生物研究所生物工程师Patrick Hsu说，这些不想要的编辑是一个值得更多关注的问题。他指出，“我确实认为这一点在这个领域一直被低估。”

CRISPR-Cas9基因编辑依赖于Cas9酶在特定的靶位点上切割DNA。细胞随后尝试利用DNA修复机制重新密封这种DNA断裂。这些机制并不总是完美地起作用，有时DNA片段会被删除或重排，或者不相关的DNA片段被整合到染色体中。

领导这项新研究的英国韦尔科姆基金会桑格研究所小鼠遗传学家Allan Bradley说，“细胞会尝试将DNA重新拼接在一起。但是，它并不知道哪些DNA片段彼此相邻。”

人们经常利用CRISPR产生小片段DNA缺失，希望这样能够破坏一个基因的功能。但是在检查CRISPR编辑时，Bradley和他的同事们发现了大片段DNA---通常长数千个碱基---的缺失和复杂的DNA序列重排，这些重排导致之前相隔遥远的DNA序列被拼接在一起。这种现象在他们测试的所有三种细胞类型---小鼠胚胎干细胞、小鼠造血祖细胞和一种人分化细胞系---中都很普遍。

质量控制

许多人使用一种扩增短片段DNA的方法来测试他们的编辑是否已经完成。但是美国布兰戴斯大学分子生物学家James Haber说，这种方法可能会错过更大的DNA片段缺失和重排。

Hsu指出，这些缺失和重排应当仅在依赖于DNA切割的基因编辑技术中发生，而在避免切割DNA的其他类型的CRISPR改进版本中不会发生。比如，一种被称作碱基编辑的方法使用一种改进的CRISPR系统在不切割DNA的情形下将一个DNA碱基转换为另一个碱基（Nature, doi:10.1038/nature.2016.19773）。其他的系统使用与其他的酶融合在一起的灭活Cas9来打开或关闭基因，或者靶向RNA（Nature, doi:10.1038/531156a）。

一些科学家已经在寻找更大的DNA片段缺失。位于美国马萨诸塞州剑桥市的eGenesis公司正在利用基因编辑对猪器官进行基因改造以便用于移植。该公司联合创始人兼首席科学官Luhan Yang说，这家公司的科学家们经常利用多种方法来寻找大片段DNA和小片段DNA缺失。同样地，在另一家致力于开发基于CRISPR的疗法的公司Intellia那里，科学家们在小鼠肝脏基因编辑研究中一直在寻找大片段DNA缺失。Intellia公司高级副总裁Thomas Barnes说，到目前为止，他们没有发现任何大片段DNA缺失的证据。他说，这可能是因为他的团队研究的细胞不经常发生分裂。相比之下，Bradley及其同事们开展这项新的研究使用了活跃地发生分裂的细胞。

Haber说，总体而言，这些不想要的编辑是一个值得更多关注的问题，但这不应该阻止任何人使用CRISPR。他说，“这意味着当人们使用它时，他们需要开展更加充分的分析。了解您的突变是否与您认为的一样，这一点是非常重要的。”

参考资料：

CRISPR gene editing produces unwanted DNA deletions

Michael Kosicki, Kärt Tomberg & Allan Bradley. Repair of double-strand breaks induced by CRISPR–Cas9 leads to large deletions and complex rearrangements. Nature Biotechnology, Published online: 16 July 2018, 10.1038/nbt.4192.