用于检测【甲氧基聚乙二醇】和【聚乙二醇化蛋白】的ELISA试剂盒（MP-0001-1Kit）

来源：作者：人气：-发表时间：2015-08-28 10:51:00【大中小】

用于检测【甲氧基聚乙二醇】和【聚乙二醇化蛋白】的ELISA试剂盒（MP-0001-1Kit）

甲氧基聚乙二醇 ELISA试剂盒(货号：MP-0001-1Kit)的应用： 用于检测分子量大于等于2kDa 游离甲氧基聚乙二醇和聚乙二醇化蛋白，试剂盒只用于科研，不可用于诊断或治疗

甲氧基聚乙二醇 ELISA试剂盒(货号：MP-0001-1Kit)产品介绍：
治疗蛋白通过结合甲氧基聚乙二醇链实现聚乙二醇化，蛋白聚乙二醇化后，可减缓蛋白水解和循环系统清除速率来延长半衰期，因此可以增加其疗效。评估聚乙二醇化蛋白的药效，通常情况下应对多肽链的特异性进行分析。但这些方法需要消耗大量时间，且建立目标蛋白的ELISA非常昂贵。甲氧基聚乙二醇 ELISA试剂盒(货号：MP-0001-1Kit)可以检测甲氧基聚乙二醇链，因此适合评估聚乙二醇化生物制剂和甲氧基聚乙二醇的药效。

该检测试剂盒基于夹心ELISA原理，它应用了两个抗-PEG小鼠单克隆抗体。针对PEG的聚乙二醇主链的特异性抗体包被在96孔板上，用于捕获。另外一种专一性抗体结合了辣根过氧化物酶，与甲氧基聚乙二醇的末端甲氧基发生特异性结合，进行检测。

甲氧基聚乙二醇 ELISA试剂盒可用于检测游离甲氧基聚乙二醇（图1）和带有一个或多个甲氧基聚乙二醇链的聚乙二醇化蛋白（图2）。不过，它不能检测缺少末端甲氧基的PEG链。试剂盒的灵敏度随着甲氧基聚乙二醇链的长度而变化，因此甲氧基聚乙二醇或聚乙二醇化的分子可以生成一个标准曲线。研究表明，甲氧基聚乙二醇 ELISA试剂盒可识别分子量大于等于2kDa的甲氧基聚乙二醇。试剂盒提供5kDa 甲氧基聚乙二醇-氨的标准品，可方便用户去检测试剂盒的性能。

甲氧基聚乙二醇 ELISA试剂盒(货号：MP-0001-1Kit)分析方法：
首先将100ul的HRP抗-甲氧基聚乙二醇加入到微孔板中，然后加入100ul的稀释样品和标准品，在微孔板振荡器上混匀1小时。冲洗微孔以后，加入100ul的TMB到微孔中，孵育20分钟，结果会产生蓝色。加入1N HCL 100ul终止反应，蓝色会变为黄色，检测其在450nm处的吸光值。甲氧基聚乙二醇的浓度从标准曲线上获得。

甲氧基聚乙二醇 ELISA试剂盒(货号：MP-0001-1Kit)包含以下内容：

抗-PEG包被的96孔板（12个可拆开的条，每条8孔），在-20℃下储存
HRP 抗-甲氧基聚乙二醇复合物，25ul（1瓶）。在-20℃下储存
甲氧基聚乙二醇稀释液，50ml
5kDa 甲氧基聚乙二醇-氨标准品，100ul（1瓶）。在-20℃下储存
甲氧基聚乙二醇清洗缓冲液，60ml
TMB试剂，11ml
终止液，11ml

需提供以下试剂或耗材：

移液器和枪头
蒸馏水或去离子水
聚丙烯或玻璃管
漩涡混合器
微孔板振荡仪（混合速度，150转/分钟）
平板垫圈
在450nm处光密度在0-4的平板阅读器
绘图软件

标准液的制备：

1、标记8支聚丙烯管或玻璃管，浓度为20,10,5,2.5,1.25,0.625，0.3125和0ng/ml
2、制备20ng/ml的标准品，标记在5kDa 甲氧基聚乙二醇标准品标签上
3、加入250ul的稀释液到管中，标记为10,5,2.5,1.25,0.625,0.3125和0ng/ml
4、吸取250ul的20ng/ml 甲氧基聚乙二醇标准品到管子中，标记10ng/ml，并混合。此试剂盒提供10ng/ml PEG-BSA标准品。
5、通过连续稀释相同地制备5,2.5,1.25,0.625和0.3125ng/ml的标准品

分析过程：

1、保护支持板上合适数量的包被孔
2、加入100ul的HRP 抗-甲氧基聚乙二醇复合物到孔中
3、吸取100ul标准品和样品到孔中（建议标准品和样品分别一式三份）
4、在150转每分钟的微孔板振荡器上室温（25℃）孵育1小时
5、使用一个平板垫圈，清洗孔6次，每孔加入400ul的清洗液
6、吸取100ul的TMB试剂到每个孔中
7、在150转/分钟的微孔板振荡器上轻轻地混合20分钟
8、加入100ul的终止液到每个孔中终止反应
9、轻轻混合直到蓝色变为黄色
10、5分钟内读取450nm处的吸收值

结果计算：

1、读取参考标准品和样品在450nm处的平均吸光值
2、用平均吸光值和浓度值做标准曲线，Y轴是吸光值，X轴是浓度
3、用合适的模型和电脑绘图软件导入数据
4、使用每个样品的平均吸光值来确定甲氧基聚乙二醇或聚乙二醇化蛋白的浓度值
5、浓度乘以稀释因子计算出血清或血浆样品中聚乙二醇化蛋白的实际浓度
6、如果样品的吸光度值不在标准曲线范围，样品需要重新稀释和检测

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