检测PI 3-激酶活性的试剂盒

仅用于体外实验，质量保证12个月。在-20℃下储存，避免反复冷冻/复溶 

试剂盒组成

2×反应缓冲液（2×1.5ml）
1mM ATP（400ul）
脂类底物（8管）                                                        
对照PI 3-激酶（5ug）

您需要提供以下试剂和耗材

(γ³²P)-ATP
1M HCL
三氯甲烷/甲醇 1:1
2M乙酸/异丙醇 1:2
硅胶TLC平板
闪烁计数器

描述
PI 3-激酶分析试剂盒为高灵敏和定量检测PI 3-激酶活性或筛选PI 3-激酶抑制剂提供了高效且操作简单的工具。

PI3-激酶活性由放射性标记(γ³²P)-ATP的量来进行评估；底物随后使用薄层色谱分离出来，且它的放射性在闪烁计数器中进行检测

背景

磷脂酰肌醇三激酶（PI3Ks）是一家族的酶，在细胞调节机制中发挥着关键作用。PI3Ks可以磷酸化磷酸肌醇(PIs)的3’-OH位置产生油脂二级信号。此功能可与许多生化反应联系，比如细胞生长，细胞分离，细胞生存，细胞增殖和迁移。基于结构相似性和底物专一性，PI3K家族可以分为I,II和III三个级别。

所有的人Class I由催化亚族（分子量大约：110kDa）和非催化亚族（分子量50,55,85,87或101KDa）组成。他们是磷酸肌醇（PI），磷酯酰肌醇-4-单-磷酸(PIP)和磷脂酰肌醇-4，5-双磷酸（PIP2)。

制备(γ³²P)-ATP混合液

制备ATP和(γ³²P)-ATP混合液，浓度为240uM.每次分析需要10ul的(γ³²P)-ATP混合液

制备脂质底物

每一脂质底物瓶中包含一定量的PI，可以分析12次，在瓶中装满脂质底物和125ul的水，充分摇匀。
在超声水浴锅中超声1h

激酶分析

按照下面的配方制备激酶分析混合液
反应缓冲液：25ul
脂质底物：10ul
酌情稀释的PI 3激酶样品：5ul
室温下孵育5分钟
加入10ul的(γ³²P)-ATP混合液启动反应
37℃环境下培养15分钟
加入100ul HCL（1M）终止反应并摇匀

萃取油脂

加入三氯甲烷/甲醇1:1 300ul
漩涡混合混合液，离心1分钟，分离两相
去除上层水相
用400ul HCL（1M）清洗有机相，去除水相

定量

将100ul的有机相转移到硅胶TLC平板中，在2M的乙酸/异丙醇（1:2）中运行
暴露平板，进行观察；PI 3-激酶放在闪烁计数器中进行定量
100ul的清洗过的三氯甲烷相可以通过液体闪烁器进行计数

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