Nature最新研究推翻了关于CRISPR Cas9的一个普遍假设：Cas9的惊人作用
摘要：新研究推翻了关于 CRISPR Cas9 的一个普遍假设。
21 世纪初，当科学家发现细菌如何保护自己免受病毒入侵者（噬菌体）的侵害时，他们几乎不知道自己偶然发现了一种可用于编辑活细胞 DNA 的革命性工具。
这个名为 CRISPR 的系统被植入到细菌的基因组中，细菌可以通过储存入侵者的基因片段（称为间隔物）来“记住”过去的病毒攻击。
在该系统最著名的版本 CRISPR-Cas9 中，这些存储的记忆随后被复制到微小的 RNA 向导中，这些向导 RNA 武装 Cas9 蛋白，使其像武器一样在细菌下次遇到匹配的噬菌体时切碎入侵者。
为了发动攻击，Cas9 还依赖一种名为 PAM 的短 DNA 标签，作为“可以在此处切割”的标志。
科学家已经修改了 CRISPR-Cas9 来编辑动物和人类细胞，甚至开发基因疗法。
但关于 CRISPR-Cas9 系统如何运作的一个关键谜题尚不清楚：细菌如何形成新的免疫记忆？
图1 Cas9通过感知CRISPR RNA丰度来调控CRISPR间隔序列的获取
为了研究这个谜团，密歇根大学生物化学、微生物学和免疫学系的Yan Zhang博士实验室发表了一篇论文，推翻了关于 Cas9 的一个普遍假设——即不与其通常的 RNA 伙伴结合，“空”或 apo 形式的 Cas9 是没有功能的。
捕捉新的记忆
直到最近，只有少数基因研究阐明了 CRISPR-Cas9 如何形成免疫记忆，而且这些研究大多局限于 化脓性链球菌 （更广为人知的名称是 A 组链球菌）和 嗜热链球菌 （常见于酸奶中）使用的 II-A 型系统。
在这些 II-A 系统中，Cas9 必须与其 RNA 伙伴之一 tracrRNA 协同工作，帮助选择 PAM 旁边的正确位置来捕获新的记忆。
然而，在占 Cas9 家族 40% 以上的 II-C 型品牌中，记忆获取过程尚不十分清楚。
Zhang教授的团队，包括博士后研究员Xufei Zhou博士和博士生Xin Li，开发了一种用于研究记忆习得的新型模型系统，利用脑膜炎奈瑟菌 （可 导致脑膜炎），并用噬菌体感染它，以查看是否可以在实验室环境下形成记忆，然后调整部分免疫机制以查看会发生什么。
“当我们开始这个项目时，Cas9 已经被称为记忆获取的 PAM 选择器。
“这两种 RNA 的作用尚不清楚，但我们假设它们对于 Cas9 帮助细菌获得新记忆也一定具有某种重要性，”Zhang教授说。
新的垫片
噬菌体感染后，研究小组利用生物化学和计算生物学与生物信息学系的同事 Lydia Freddolino 博士和 Rucheng Diao 博士的深度测序和信息支持，检查了 CRISPR 阵列的“生长”前导端。
在那里，他们看到来自病毒基因组的新间隔物被添加。
接下来，他们删除了tracrRNA基因，并惊讶地发现间隔物的获得得到了极大的刺激。
放回 tracrRNA 可使增强的获取恢复到正常水平。
在他们对 crRNA 的研究中也出现了类似的模式：没有 crRNA 时，Cas9 加快了获取速度；而随着 crRNA 的恢复，获取速度又下降了。
Zhang教授说：“我们发现，没有 RNA，记忆形成就会受到高度刺激，达到非常强劲的水平。”
“这对我们来说真的令人惊讶，我想说，对整个领域来说也是如此——因为Cas9一直以来都被认为需要RNA伴侣，无论是作为免疫效应器还是基因编辑器。这是首次报道非RNA负载的‘空’apoCas9的生物学功能。”
基于这些发现，他们提出 Cas9 可以作为 RNA 水平的监测器：当 CRISPR RNA 丰度较低时，表明细菌细胞携带较短的 CRISPR 和较少的免疫记忆，apoCas9 就会形成，并且可以动态地促进间隔区获取，通过快速建立记忆库来保护脆弱的细菌免受感染。
图2 对于所有Northern和Western印迹实验，上样量对照与目的信号均在同一块凝胶/膜上进行检测。
短暂免疫记忆
研究小组进一步证明了细菌可能遇到 CRISPR 阵列过短的三种自然条件。
一个阶段是最早的进化阶段，此时阵列刚刚诞生，并且只包含很少（如果有的话）间隔内容。
在这个阶段，Cas9 将没有其 CRISPR RNA 伴侣，并且主要以 apo 形式存在。
第二种和第三种情况都涉及较长的 CRISPR 阵列突然坍缩为较短的阵列，这要么是细菌抛弃不需要的有害或自身免疫记忆以获得新的有益特性的一种方式，要么是同源重组的结果，即两个相似的 DNA 序列（又名 CRISPR 重复）交换片段，从而在此过程中抹去中间的 CRISPR 记忆。
这项研究扩展了 Cas9 的已知功能，并填补了 CRISPR-Cas9 如何维持记忆稳态的关键缺失部分。
这种动态反馈回路为细菌如何保护其免疫记忆的深度提供了一种新的思维方式。
它还可能启发设计基于 CRISPR 的分子记录或 DNA 条形码工具用于研究和医学的新方法。
参考资料
[1] Cas9 senses CRISPR RNA abundance to regulate CRISPR spacer acquisition
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