谷胱甘肽亲和介质——层析介质优选西宝生物
GST亲和介质是专门设计用于分离纯化谷胱甘肽S-转移酶(GST)标签蛋白、其它来源的谷胱甘肽S-转移酶以及和谷胱甘肽具有亲和作用的蛋白的亲和层析介质。GST亲和层析具有操作条件温和、特异性强的特点,有利于蛋白的活性保持和高纯度目标蛋白的快速制备,通常一步亲和层析即可得到高纯度的目标蛋白。
参数
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指标
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基质
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4%交联琼脂糖凝胶
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配基
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谷胱甘肽
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形状
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球形
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介质平均粒径
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90 μm (45-165)
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配基密度
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~8 mg GSH/mL wet gel
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动态载量
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~10 mg GST融合蛋白/mL wet gel (Mr 42 kDa) ~3.5 mg GST(大鼠肝脏)/mL wet gel
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流速高达(25℃)
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450 cm/h
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推荐流速
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<150 cm/h
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耐压高达
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0.3 MPa (3 bar)
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pH稳定性
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3~12
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化学稳定性
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在常用的水溶性缓冲液中均稳定,在70%乙醇、30%异丙醇、6M盐酸胍、1M乙酸(pH 4)中均稳定
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物理稳定性
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溶液的pH或离子强度影响介质的体积变化率<2%
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保存
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4-8 ℃(20%乙醇)
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西宝生物谷胱甘肽亲和层析介质广泛用于GST融合蛋白、其它来源的谷胱甘肽S-转移酶以及和谷胱甘肽具有亲和作用的蛋白的分离纯化。实际操作中可采用静态吸附、重力柱、离心柱、层析柱等模式进行蛋白质的分离纯化,其中柱层析操作自动化程度高、分离纯化效果好、重现性好,应用较为广泛。
- 装柱:取适量介质放置于烧杯中,匀浆浓度约为50-60%,搅拌均匀后备用(介质和缓冲液均处于纯化时所需的温度);清洗层析柱,排出柱底部转接头筛网/垫片上的气泡,拧紧底部的转接头,加入适量纯水至约1 cm高度;介质搅拌均匀后用玻璃棒紧靠柱子内壁引流,将介质匀速、连续地加入到层析柱中(这可以减少气泡的产生);介质沉降5-30 min(上层溶液澄清)后小心装上柱子顶部的转换接头(避免残留气泡和破坏胶面),然后依次以1、2 mL/min的流速用纯水(或平衡缓冲液)压柱子各2min,最后用5 mL/min的流速压柱子3-5 min至胶面稳定不变(可在界面处做记号便于后期观察胶面变化情况),将顶部的转换接头拧松,缓慢向下移动至胶面后拧紧转换接头。
- 平衡:用5CV(柱体积)的平衡缓冲液(50 mM Tris-HCl + 0.15 M NaCl,pH 8.0,)平衡层析柱(添加适当浓度(0.1-0.2 M)的NaCl可抑制蛋白的非特异性吸附,添加适当浓度(1-10 mM)的DTT可提高部分蛋白的稳定性和结合载量),流速为2 ml/min(后续操作流速均为2 mL/min,操作流速不高于装柱流速的75%),至流出液电导和pH不变(与平衡液一致)。原位清洗:为了避免不同样品间的相互干扰,或者当介质污染比较严重时(反压增加),需要对介质进行在位清洗。
- 进料:样品缓冲液应尽可能与平衡液一致。菌体破碎时直接采用平衡缓冲液溶解(1 g菌体对应5-10 mL缓冲液);固体样品可用平衡液溶解配制;低浓度样品溶液可用平衡液透析;高浓度样品溶液可用平衡液稀释。为了避免堵塞层析柱,样品应经离心或微滤(0.45μm)处理。进料量根据介质的载量和料液中目标蛋白的含量计算(介质的动态载量与流速密切相关,较低流速有利于提高载量)。
- 淋洗:上样完毕后继续用平衡缓冲液淋洗至基线。
- 洗脱:用洗脱缓冲液(50 mM Tris-HCl+10 mM GSH,pH 8.0,GSH浓度需要根据目标蛋白的结合力进行适当调整,GSH易被氧化,现用现配,)洗脱,收集流出液。
- 原位清洗:介质使用数次(具体次数与原料的种类和来源及实验要求有关)后,介质上会有部分沉淀物、变性蛋白及非特异性吸附的蛋白,导致介质结合能力的下降,需要对介质进行在位清洗(100 cm/h)。
(2)去除疏水性结合的蛋白、脂蛋白和脂类物质,可用3-4 CV的70%乙醇或30%异丙醇清洗(20 min以上),并用3-5 CV的纯水冲洗。
层析介质:GST QZT 4FF介质(2.55 cm × 1.0 cm I.D., CV=2.0 mL);
对照介质(2.55 cm × 1.0 cm I.D., CV=2.0 mL, 国际领先品牌);
Buffer A: 50 mM Tris-HCl+0.15M NaCl, pH 8.0;
Buffer B: 50 mM Tris-HCl+10 mM GSH (GSH易氧化,现配现用);
上样量:10 mL;
流速:0.5 mL/min。
层析介质:GST QZT 4FF介质(2.55 cm × 1.0 cm I.D., CV=2.0 mL);
对照介质(2.55 cm × 1.0 cm I.D., CV=2.0 mL, 国际领先品牌);
Buffer A: 50 mM Tris-HCl+0.15M NaCl, pH 8.0;
Buffer B: 50 mM Tris-HCl+10 mM GSH (GSH易氧化,现配现用);
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