谷胱甘肽亲和介质——层析介质优选西宝生物

来源：作者：人气：-发表时间：2015-10-16 09:47:00【大中小】

GST亲和介质是专门设计用于分离纯化谷胱甘肽S-转移酶（GST）标签蛋白、其它来源的谷胱甘肽S-转移酶以及和谷胱甘肽具有亲和作用的蛋白的亲和层析介质。GST亲和层析具有操作条件温和、特异性强的特点，有利于蛋白的活性保持和高纯度目标蛋白的快速制备，通常一步亲和层析即可得到高纯度的目标蛋白。

西宝生物谷胱甘肽亲和介质以高交联的琼脂糖凝胶为基质，以谷胱甘肽为配基，通过间隔臂长短和配基密度的合理调控，产品具有载量高（~10 mg GST融合蛋白/ml介质）、特异性强、物理和化学稳定性良好、使用寿命长、易放大的特点，是研发和生产的理想选择。

一、产品特性

参数	指标
基质	4%交联琼脂糖凝胶
配基	谷胱甘肽
形状	球形
介质平均粒径	90 μm (45-165)
配基密度	~8 mg GSH/mL wet gel
动态载量	~10 mg GST融合蛋白/mL wet gel (Mr 42 kDa) ~3.5 mg GST(大鼠肝脏)/mL wet gel
流速高达（25℃）	450 cm/h
推荐流速	<150 cm/h
耐压高达	0.3 MPa (3 bar)
pH稳定性	3~12
化学稳定性	在常用的水溶性缓冲液中均稳定，在70%乙醇、30%异丙醇、6M盐酸胍、1M乙酸（pH 4）中均稳定
物理稳定性	溶液的pH或离子强度影响介质的体积变化率<2%
保存	4-8 ℃（20%乙醇）

二、应用范围

西宝生物谷胱甘肽亲和层析介质广泛用于GST融合蛋白、其它来源的谷胱甘肽S-转移酶以及和谷胱甘肽具有亲和作用的蛋白的分离纯化。实际操作中可采用静态吸附、重力柱、离心柱、层析柱等模式进行蛋白质的分离纯化，其中柱层析操作自动化程度高、分离纯化效果好、重现性好，应用较为广泛。

三、操作步骤

柱层析操作通常包括装柱、平衡、进料、淋洗、洗脱、再生等步骤（以5.0 × 1.6 cm I.D.，柱高5 cm，柱体积10 ml为例（层析柱（空柱）尺寸：20.0 × 1.6 cm I.D.）。平衡：用5-10CV的平衡缓冲液（20-50 mM PB或Tris/HCl，pH 7.4-8.0，可加入0.15 M NaCl抑制非特异吸附）平衡层析柱，至流出液电导和pH不变（与平衡液一致）。

装柱：取适量介质放置于烧杯中，匀浆浓度约为50-60%，搅拌均匀后备用（介质和缓冲液均处于纯化时所需的温度）；清洗层析柱，排出柱底部转接头筛网/垫片上的气泡，拧紧底部的转接头，加入适量纯水至约1 cm高度；介质搅拌均匀后用玻璃棒紧靠柱子内壁引流，将介质匀速、连续地加入到层析柱中（这可以减少气泡的产生）；介质沉降5-30 min（上层溶液澄清）后小心装上柱子顶部的转换接头（避免残留气泡和破坏胶面），然后依次以1、2 mL/min的流速用纯水（或平衡缓冲液）压柱子各2min，最后用5 mL/min的流速压柱子3-5 min至胶面稳定不变（可在界面处做记号便于后期观察胶面变化情况），将顶部的转换接头拧松，缓慢向下移动至胶面后拧紧转换接头。
平衡：用5CV（柱体积）的平衡缓冲液（50 mM Tris-HCl + 0.15 M NaCl，pH 8.0，）平衡层析柱（添加适当浓度（0.1-0.2 M）的NaCl可抑制蛋白的非特异性吸附，添加适当浓度（1-10 mM）的DTT可提高部分蛋白的稳定性和结合载量），流速为2 ml/min（后续操作流速均为2 mL/min，操作流速不高于装柱流速的75%），至流出液电导和pH不变（与平衡液一致）。原位清洗：为了避免不同样品间的相互干扰，或者当介质污染比较严重时（反压增加），需要对介质进行在位清洗。
进料：样品缓冲液应尽可能与平衡液一致。菌体破碎时直接采用平衡缓冲液溶解（1 g菌体对应5-10 mL缓冲液）；固体样品可用平衡液溶解配制；低浓度样品溶液可用平衡液透析；高浓度样品溶液可用平衡液稀释。为了避免堵塞层析柱，样品应经离心或微滤（0.45μm）处理。进料量根据介质的载量和料液中目标蛋白的含量计算（介质的动态载量与流速密切相关，较低流速有利于提高载量）。
淋洗：上样完毕后继续用平衡缓冲液淋洗至基线。
洗脱：用洗脱缓冲液（50 mM Tris-HCl+10 mM GSH，pH 8.0，GSH浓度需要根据目标蛋白的结合力进行适当调整，GSH易被氧化，现用现配，）洗脱，收集流出液。
原位清洗：介质使用数次（具体次数与原料的种类和来源及实验要求有关）后，介质上会有部分沉淀物、变性蛋白及非特异性吸附的蛋白，导致介质结合能力的下降，需要对介质进行在位清洗（100 cm/h）。

（1）去除沉淀物及变性蛋白，可用2 CV 6 M盐酸胍清洗，然后立即用5 CV中性PBS缓冲液平衡至中性。

（2）去除疏水性结合的蛋白、脂蛋白和脂类物质，可用3-4 CV的70%乙醇或30%异丙醇清洗（20 min以上），并用3-5 CV的纯水冲洗。

（3）也可用2 CV 0.01-0.1 M的NaOH清洗，然后立即用5 CV中性PBS缓冲液平衡至中性（优先采用方法（1）和（2）清洗）。

其它注意事项：在装柱、使用和保存柱子的时候，要避免柱子流干，气泡进入。

四、具体应用实例

实例一：蛋白样品：GST融合蛋白（菌体破碎：按照1 g菌体对应10 ml Buffer A配置菌体溶液，冰水浴中超声破碎30min，超声3S/停3S）、离心（1000 g,4度,15 min），分子量约为42kDa）；

层析介质：GST QZT 4FF介质（2.55 cm × 1.0 cm I.D., CV=2.0 mL）；

对照介质（2.55 cm × 1.0 cm I.D., CV=2.0 mL, 国际领先品牌）；

Buffer A: 50 mM Tris-HCl+0.15M NaCl, pH 8.0；

Buffer B: 50 mM Tris-HCl+10 mM GSH (GSH易氧化，现配现用)；

上样量：10 mL；

流速：0.5 mL/min。