重磅！Nature和Science同日打擂台发表新型DNA/RNA碱基编辑器，可校正点突变

来源：作者：人气：-发表时间：2017-10-27 09:34:00【大中小】

自从5年前CRISPR热潮开始以来，科学家们就竞相开发这种强大工具的更加全面或高效的版本，从而能够极大地简化DNA编辑。本周发表在Science期刊和Nature期刊上的两项研究进一步扩大了CRISPR的使用范围，开发出一种更加微妙的被称作碱基编辑（base editing）的方法来修复遗传物质：一项研究扩展了一种编辑DNA的策略，而另一项研究通过对RNA进行碱基编辑而开辟了新的领域

碱基编辑（base editing）与CRISPR的比较
图片来自 C. BICKEL/SCIENCE

这两项研究都为遗传研究和甚至治愈疾病开辟了新的途径。作为这篇最新的Nature论文的共同作者，美国哈佛大学化学家David Liu说，“人们不应认为碱基编辑比CRISPR更好---它们只是不同而已。这就像是问一艘船或一辆车哪个更好。”在2016年发表在Nature期刊上的一篇论文中，Liu开创了DNA碱基编辑技术[3]（参见新闻报道：三篇Nature文章揭示CRISPR/Cas9基因组编辑取得重大进展）。

CRISPR是由一种原始的细菌免疫系统改编而成的，它的作用方式是首先在基因组的一个靶位点上切割双链DNA。相比之下，碱基编辑并不切割DNA双螺旋，而是在组成DNA或RNA的四个碱基中，利用酶精确地重新排列其中的一个碱基上的一些原子，从而将这个碱基转化为一个不同的碱基，同时不改变其周围的碱基。这种能力大大增加了改变遗传物质的选择手段。美国马萨诸塞大学医学院CRISPR研究员Erik Sontheimer说，“这是一种很有价值的补充，应当会占有一席之地。”

很多人类疾病是由单碱基突变引起的。CRISPR很难高效地和干净利落地校正这些所谓的点突变，因此碱基突变可能提供一种更加有效的方法。在Liu的初次报道之后，中国的一个研究小组利用DNA碱基编辑技术校正人从一名患有遗传性血液疾病的病人中克隆出的人胚胎内的一种致病性突变（参见新闻报道：Science：基因编辑疗法在中国已占先机，在癌症、遗传病治疗等领域 9 项试验值得关注）[4]。

常规的CRISPR利用与一种核酸酶（最常见的是Cas9）结合在一起的向导RNA（gRNA），结合到特定的一段DNA碱基上；这种核酸酶随后切割DNA双螺旋。一种细胞修复机制试图重新连接这些被切断的DNA末端，但是有时也会插入或剔除碱基，这就使得DNA代码出现乱码，并且能够敲除一个靶基因。美国布罗德研究所CRISPR研究员张锋（Feng Zhang）说，“基于核酸酶的基因编辑非常适合用于让基因失活。”

然而，他指出，CRISPR“在作出精确的改变时效率并不高”。为了修复一个点突变，CRISPR-Cas9系统还必须引入一个具有正确碱基的“供者”DNA链，随后还要依赖于另一种被称作同源介导修复（homology-directed repair, HDR）的细胞机制。但是除非细胞发生分裂，HDR的修复效率比较差，这意味着这种策略不能在脑细胞和肌肉细胞中发挥作用，这是因为这些细胞不再自我复制。即便在分裂细胞（dividing cells）中，供者DNA也很少会插入这个切割位点。

校正点突变

碱基编辑器借用CRISPR的组分---gRNA和Cas9或其他的核酸酶，但并不切割DNA双螺旋，而且利用TadA和ADAR等脱氨酶以化学方式改变单个碱基。

大量借用CRISPR工具包的碱基编辑系统很容易在非分裂细胞（nondividing cells）中实现碱基编辑。DNA具有4个核苷酸碱基：A、C、T和G，碱基编辑会将一个碱基改变为另一个碱基。在Liu的2016年那项研究中，他的团队将gRNA与一个“死的”Cas9（dCas9）融合在一起，dCas9不能够切割整个DNA双螺旋，但是仍然能够在正确的位点上让它解链。这些研究人员将酶APOBEC1附着到gRNA-dCas9上，这会触发一系列化学反应，最终导致碱基C改变为碱基T。DNA的碱基配对规则控制着随后的碱基变化。这种配对规则规定一条DNA链上的T与另一条DNA链上的A配对。dCas9经进一步修饰后在未编辑的DNA链上产生切口，从而激活细胞的DNA修复机制，将初始与碱基C配对的碱基G转化为与这个新产生的T配对的A。

这第一个DNA碱基编辑器并不能够解决与人类疾病相关的最为常见的点突变（大约占一半）：在应当为G•C的地方存在着A•T。如今，来自Liu团队的这个新的编辑器能够修复这种点突变。该团队再次将gRNA与dCas9融合在一起，但是已知没有一种能够将A转化为G的酶。因此，他们利用来自大肠杆菌的酶TadA开出一种新型酶。这种新型酶将A转化为一种被称作肌苷（inosine, I）的碱基。随后不论是一种细胞修复机制，还是DNA自我复制过程，都会将I变成G。美国哈佛大学CRISPR研究员George Church说，“在这项研究中，重要的事情是对TadA酶进行基因改造让它具备某种非天然的功能。我佩服他们。”

张锋团队通过将gRNA与一种不同的没有切割活性的核酸酶dCas13和一种将RNA中的A转化为I的天然性酶融合在一起而构建出一种RNA碱基编辑器。与DNA中不同的是，这不会导致随后的碱基变化。含I的RNA仅像那个位点上存在一个G那样发挥作用。

鉴于RNA将来自DNA的遗传信息传递给细胞中的蛋白制造工厂，或者能够直接执行着基因调节之类的作用，它也是一种很有吸引力的治疗靶标。但是RNA仅在细胞中短暂地存在。这意味着可能需要重复地给药才会使得RNA碱基编辑器作为一种药物发挥效果，张锋团队提出这可能对短暂的症状（如局部炎症）有意义。

尽管RNA的较短寿命使得RNA碱基编辑对很多疗法并不那么有吸引力，但是Sontheimer也从中观察到好处。他说，“在某些方面，作用于RNA是更加安全的。”科学家们担心利用DNA碱基编辑器进行基因编辑可能会意外地影响基因组的错误部分---这一变化将是永久存在的。Sontheimer说，“利用RNA碱基编辑器进行碱基编辑，如果存在一定程度的脱靶效应，那么也不会将这些错误永久性地蚀刻在基因组中。”

Church说，针对碱基编辑是否比CRISPR和其他的改变核酸的技术更有优势，应当“逐案地”加以评估。他注意到，“在此之前，这听起来就像是改变碱基是不可能的。事实上，这是较为困难的，或者仅仅是效率较低的。”

张峰和Liu强调，在碱基编辑疗法进入临床试验之前，可能需要数年的时间，而且可能需要更长的时间才确定这种策略是否比现存的基因疗法更有优势。Liu说，“作出碱基编辑将是一种比人体基因疗法更好的方法的结论在科学上是短视的，而且就长期而言也是不正确的。”不过，如今已经清楚的是，作为标准CRISPR的强大替代性方法，碱基编辑如今已在游戏中了。

文章来源

[1].Nicole M. Gaudelli, Alexis C. Komor, Holly A. Rees, Michael S. Packer, Ahmed H. Badran, David I. Bryson & David R. Liu. Programmable base editing of A•T to G•C in genomic DNA without DNA cleavage. Nature, Published online 25 October 2017, doi:10.1038/nature24644

[2].David B. T. Cox, Jonathan S. Gootenberg, Omar O. Abudayyeh, Brian Franklin, Max J. Kellner, Julia Joung, Feng Zhang. RNA editing with CRISPR-Cas13. Science, Published online:25 Oct 2017, doi:10.1126/science.aaq0180

[3].Alexis C. Komor, Yongjoo B. Kim, Michael S. Packer, John A. Zuris & David R. Liu. Programmable editing of a target base in genomic DNA without double-stranded DNA cleavage. Nature, Published online 20 April 2016, doi:10.1038/nature17946

[4].Dennis Normile. China sprints ahead in CRISPR therapy race. Science, 06 Oct 2017, doi:10.1126/science.358.6359.20