Jackson ImmunoResearch二抗常见应用之流式细胞术

来源：作者：人气：-发表时间：2018-06-26 11:06:00【大中小】

在流式细胞术间接免疫荧光标记的实验中，二抗的选择对实验是否能顺利开展有着重要的影响。Jackson高品质的流式二抗产品，可提供R-PE、APC、PerCP以及各种Alexa Fluor荧光标记、针对不同免疫球蛋白及亚型的二抗产品，并能提供完整IgG和F(ab')₂片段两种形式的二抗。

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流式细胞术（Flow Cytometry,FC）的介绍

流式细胞术（Flow Cytometry,FC）是对单个细胞理化特性进行快速、精确的分析和分选的技术。这种技术可以用来对流过光学或电子检测器的一个个细胞进行连续的多种参数分析，包括：细胞 DNA含量、细胞体积、蛋白质含量、酶活性、细胞膜受体和表面抗原等。

二抗和流式细胞术间接免疫荧光标记法

流式细胞术可以用荧光标记好的一抗直接和细胞进行免疫标记反应，也可以间接的通过用荧光标记二抗和未标记的一抗结合进行。间接免疫荧光标记法的优点是：操作较简单，费用低，只需要制备相关的一抗，二抗则可广泛地选择探针分子，使用户能够将所需的探针与一抗相匹配。

图一流式细胞术直接标记（左）和间接标记（右）示意图

流式细胞术二抗的形式

整个IgG分子还是F(ab’)₂片段，选择哪种形式的二抗？

二抗形式的选择会影响到实验是否成功，整个IgG分子适应大多数情况，而在免疫荧光实验中，F(ab‘)₂片段形式的二抗是更佳的选择，因为F(ab')₂二抗可避免抗体的Fc部分与细胞上的Fc受体之间发生非特异性结合，可以帮助避免由靶外结合引起的背景。同时它们比完整抗体要小，因此穿透某些样本的效果更好。

FabuLight-Fab片段二抗，Fc特异性反应

FabulLab抗体是Fab片段二抗，与IgG或IgM一抗的Fc受体特异性反应。它们可与9种不同的荧光团和生物素结合，并能在与细胞或组织孵育之前标记一抗。在流式细胞术和免疫组化实验的操作过程中，孵育顺序的调整减少了洗涤和孵育的步骤，从而节约时间并保护细胞。

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流式细胞术荧光染料的选择

荧光染料的选择取决于很多实验变量。

仪器的能力

激发光源：是否可以激发所选的荧光染料

检测器：是否可检测荧光染料的发射波长

实验的样本

高表达量的抗原几乎可以用荧光染料标记抗体检测，而较低表达的抗原则需要用较高S/N比值的荧光染料标记的抗体检测。常用荧光的强弱如下：PE>APC>PE-Cy7>Percy-Cy5.5>FITC>APC-Cy7。

不同细胞群自发荧光水平的强弱，自发荧光水平强的则选择发射波长长的染料（如APC），自发荧光水平弱的则可选择FITC。

灵敏度的要求

即区分背景和弱阳信号的能力，而背景信号则取决于检测器的电子噪音，其他检测器的信号干扰等。

颜色分离度的要求

使用多种荧光染料时，要尽量减少荧光染料光谱的重叠。

FC常用的荧光探针的参数

Fluorophore 激发峰(nm) 发射峰 (nm)

Alexa Fluor® 488 493 519

FITC 492 520

R-Phycoerythrin R-PE many, 488 580

Allophycocyanin APC many, 650 670

Peridinin-Chlorophyll-protein, PerCP many, 488 675

Fluorophore	激发峰(nm)	发射峰 (nm)
Alexa Fluor® 488	493	519
FITC	492	520
R-Phycoerythrin R-PE	many, 488	580
Allophycocyanin APC	many, 650	670
Peridinin-Chlorophyll-protein, PerCP	many, 488	675

图二分别为荧光探针的激发光谱（左）和发射光谱（右），分别为Alexa Flor®488 /FITC（Green）、R PE（红色）、PerCP（蓝色）、Alexa Flor®647（黑色）和APC（棕色）

图二荧光探针的激发光谱（左）和发射光谱（右）

流式细胞术中Jackson二抗的使用

流式细胞术中建议的稀释浓度如下表所示

产品类型	稀释浓度
未标记的完整分子IgG和F(ab')₂片段二抗	10 - 20 µg / ml
未标记的Fab片段二抗	20-40µg/ml
所有Alexa Fluor®,DyLight,以及Cy3标记的[IgG, F(ab')₂, Fab]	1:100 - 1:800
香豆素,Cy2,FITC,TRITC,RRX以及德克萨斯红标记的[IgG, F(ab')₂, Fab]	1:50 - 1:200
Cy5标记的[IgG, F(ab')₂, Fab]	1:100 - 1:400
藻红蛋白和别藻蓝蛋白标记的[IgG, F(ab')₂, 链霉亲和素]	1:50 - 1:200
多甲藻黄素-叶绿素-蛋白质复合物标记的[IgG, F(ab')₂, 链霉亲和素]	1:25 - 1:100
生物素-SP标记的[IgG, F(ab')₂] (使用荧光标记链霉亲和素)	1:200 - 1:1,000
所有Alexa Fluor®, DyLight 405以及Cy3标记的链霉亲和素	0.5 - 2 µg / ml
Cy5标记的链霉亲和素	0.5 - 2 µg / ml
所有其他荧光探针标记的链霉亲和素	2 - 5 µg / ml

部分流式二抗产品列表

标记物	亲和纯化F(ab')₂片段化驴抗山羊IgG (H+L)二抗（经鸡，豚鼠，仓鼠，马，人，小鼠，兔，大鼠血清吸附）	亲和纯化F(ab')₂片段化山羊抗人IgG (H+L)二抗，与Fcγ片段特异性反应（经牛，马，小鼠血清吸附）	亲和纯化F（ab’）₂片段化山羊抗小鼠IgG（H+L）二抗（经人，牛，马，兔，猪血清吸附）
未标记	0.5 mg 705-006-147	1.0 mg 109-006-098	1.0 mg 115-006-146
生物素-SP	0.3 ml 705-066-147	0.5 ml 109-066-098	0.5 ml 115-066-146
Alexa Fluor® 488	0.3 mg 705-546-147	0.75 mg 109-546-098	0.75 mg 115-546-146
Fluorescein (FITC)	0.3 mg 705-096-147	1.0 mg 109-096-098	1.0 mg 115-096-146
R-Phycoerythrin	1.0 ml 705-116-147	1.0 ml 109-116-098	1.0 ml 115-116-146
Allophycocyanin (APC)	0.5 ml 705-136-147	0.5 ml 109-136-098	0.5 ml 115-136-146
Alexa Fluor® 647	0.3 mg 705-606-147	0.75 mg 109-606-098	0.75 mg 115-606-146
PerCP	0.5 ml 705-126-147	0.5 ml 109-126-098	0.5 ml 115-126-146

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